多功能蛋白穩(wěn)定性分析儀—PSA-16

北京佰司特科技有限責(zé)任公司于2023-10-01日推出了自主研發(fā)的款國(guó)產(chǎn)蛋白穩(wěn)定性分析儀，該設(shè)備性能和參數(shù)達(dá)到進(jìn)口設(shè)備的水平，價(jià)格卻遠(yuǎn)低于進(jìn)口產(chǎn)品，彌補(bǔ)了目前國(guó)產(chǎn)自主設(shè)備在蛋白穩(wěn)定性專業(yè)研究分析領(lǐng)域的空白。多功能蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16是一款無需熒光染料、高通量、低樣品消耗量的檢測(cè)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的設(shè)備。該設(shè)備基于內(nèi)源差示掃描熒光技術(shù)（intrinsic fluorescence DSF），通過檢測(cè)溫度變化/變性劑濃度變化過程中蛋白內(nèi)源紫外熒光的改變，獲得蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性(Tm值)、化學(xué)穩(wěn)定性（Cm值）等參數(shù)?？蓱?yīng)用于蛋白緩沖液條件篩選及優(yōu)化、小分子與蛋白結(jié)合情況的定性測(cè)定、蛋白質(zhì)修飾及改造后的穩(wěn)定性測(cè)定、蛋白變/復(fù)性研究、不同批次間蛋白穩(wěn)定性對(duì)比等多個(gè)方面。

技術(shù)原理：

蛋白跟核酸不一樣，核酸都是由四個(gè)堿基組成，只是組成的順序不一樣，但是整體的結(jié)構(gòu)都是類似的雙螺旋結(jié)構(gòu)。而蛋白由20多種不同氨基酸組成，需要折疊成正確的三維結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮自身作用。所以每個(gè)不同功能的蛋白長(zhǎng)得樣子其實(shí)都是不同的。

蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)決定其功能，行使功能需要正確折疊。蛋白由20多種不同氨基酸組成，需要折疊成正確的三維結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮自身作用。蛋白質(zhì)在一定的物理和化學(xué)條件（加熱、加壓、脫水、振蕩、紫外線照射、超聲波、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、重金屬鹽、十二烷基硫酸鈉）下，其空間構(gòu)象容易發(fā)生改變而失活，因此研究蛋白的構(gòu)象和構(gòu)型變化對(duì)其應(yīng)用有重要的價(jià)值。蛋白質(zhì)的變性作用主要是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)被破壞。天然蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是通過氫鍵等次級(jí)鍵維持的，而變性后次級(jí)鍵被破壞，蛋白質(zhì)分子就從原來有序的卷曲的緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o序的松散的伸展?fàn)罱Y(jié)構(gòu)（但一級(jí)結(jié)構(gòu)并未改變）。熱變性是蛋白質(zhì)變性中常見的一類現(xiàn)象。

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)多肽鏈在溫度影響下的形變能力，主要體現(xiàn)在溫度改變時(shí)多肽鏈獨(dú)特的化學(xué)特性和空間構(gòu)象的變化，變化越小熱穩(wěn)定性越高。蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性受到不同溫度、pH值、離子強(qiáng)度等外界因素的影響，在生物技術(shù)、藥物研發(fā)以及食品工業(yè)等領(lǐng)域，具有重要意義。

蛋白質(zhì)變性溫度是生物學(xué)家們研究蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性的一個(gè)重要的概念，是指蛋白質(zhì)在特定溫度條件下受到熱力作用時(shí)，其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的溫度點(diǎn)，一般溫度較高時(shí)，蛋白質(zhì)從穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)變化成松散的無序結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性一般使用熱變性中點(diǎn)溫度(melting temperature，Tm)來表示，即蛋白質(zhì)解折疊50%時(shí)的溫度。蛋白質(zhì)的熱變性過程與其空間構(gòu)象的改變密切相關(guān)，Tm值能反映變溫過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象改變的趨勢(shì)，是衡量蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)。蛋白質(zhì)Tm值的測(cè)定在生物醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用，如嗜熱蛋白、工業(yè)酶等的改造與篩選，蛋白質(zhì)藥物與配體、制劑或輔料的相互作用，蛋白質(zhì)藥物的緩沖液穩(wěn)定條件篩選等。

差示掃描熒光法(differential scanning fluorimetry, DSF)是一種方便快捷的高通量藥物篩選及靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)的方法，通過熒光染料或蛋白內(nèi)源熒光信號(hào)檢測(cè)升溫過程中蛋白構(gòu)象的變化計(jì)算其熔解溫度Tm（折疊蛋白與去折疊蛋白相等時(shí)的溫度）。蛋白中的色氨酸和酪氨酸可以被280 nm的紫外光激發(fā)并釋放出熒光，其熒光性質(zhì)與所處的微環(huán)境密切相關(guān)。蛋白變性過程中，色氨酸從疏水的蛋白內(nèi)部逐漸暴露到溶劑中，熒光釋放的峰值也從330 nm逐漸轉(zhuǎn)移到350 nm。該方法具有蛋白樣品消耗量少、通量高、溫度變化范圍廣及數(shù)據(jù)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性（蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性參數(shù)及其影響因素）、蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象、蛋白-配體相互作用及蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、YI制劑、輔助因子等領(lǐng)域的研究。

1.    抗體或疫苗制劑、酶制劑的高通量篩選

2.    抗體或疫苗、酶制劑的化學(xué)穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估、等溫穩(wěn)定性研究等

3.    生物仿制藥相似性研究（Biosimilar Evaluation）

4.    抗體偶聯(lián)藥物（ADC）研究

5.    多結(jié)構(gòu)域去折疊特性研究

6.    物理和化學(xué)條件強(qiáng)制降解研究

7.    蛋白質(zhì)變復(fù)性研究（復(fù)性能力、復(fù)性動(dòng)力學(xué)等）

8.    膜蛋白去垢劑篩選，膜蛋白結(jié)合配體篩選（Thermal Shift Assay）

9.    基于靶標(biāo)的高通量小分子藥物篩選（Thermal Shift Assay）

10.    蛋白純化條件快速優(yōu)化等

差示掃描熒光法(differential scanning fluorimetry, DSF)包括兩種：染料法DSF、內(nèi)源DSF（intrinsic DSF）。

常用的染料法DSF是通過標(biāo)記染料來檢測(cè)升溫過程中蛋白構(gòu)象的變化。比如SYPRO Orange，是一種環(huán)境敏感的疏水染料，當(dāng)溫度升高時(shí)，蛋白去折疊，疏水部分暴露出來，染料與蛋白質(zhì)的疏水部分特異性結(jié)合，熒光增強(qiáng)。在有特定化合物或配體結(jié)合的情況下，蛋白穩(wěn)定性會(huì)上升，表現(xiàn)為熔解溫度的上升。

內(nèi)源DSF（intrinsic DSF）則是基于蛋白去折疊過程中色氨酸發(fā)射光譜的位移進(jìn)行檢測(cè)。通過檢測(cè)溫度變化/變性劑濃度變化過程中蛋白內(nèi)源紫外熒光（350 nm/330 nm比值）的改變，獲得蛋白的熱穩(wěn)定性(Tm值)、化學(xué)穩(wěn)定性（Cm值）等參數(shù)。相比傳統(tǒng)的方法，無需添加染料，通量高，樣品用量少，數(shù)據(jù)精度高。

產(chǎn)品介紹：

多功能蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16是一款無需加入熒光染料、高通量、低樣品消耗量檢測(cè)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的設(shè)備。該設(shè)備基于內(nèi)源差示掃描熒光技術(shù)（intrinsic fluorescence DSF），在天然條件下，根據(jù)內(nèi)源熒光和散射光的變化與三級(jí)結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系，通過檢測(cè)溫度變化/變形劑濃度變化過程中蛋白內(nèi)源紫外熒光的改變，獲得蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性(Tm值)、化學(xué)穩(wěn)定性（Cm值）等參數(shù)，無需對(duì)蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，可以直接測(cè)定蛋白在不同緩沖液條件中的Tm值。

PSA-16可用于測(cè)定不同buffer中蛋白的Tm值變化，獲得蛋白質(zhì)正確折疊的ZUI優(yōu)buffer條件；測(cè)定不同detergent條件下膜蛋白Tm值，進(jìn)行detergent篩選；測(cè)定不同添加劑對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響；測(cè)定添加配體后Tm值變化進(jìn)行配體結(jié)合篩選；測(cè)定蛋白中變性部分的比例，進(jìn)行質(zhì)量控制；測(cè)定蛋白Tm值與濃度的相關(guān)性，獲得ZUI優(yōu)蛋白濃度進(jìn)行后續(xù)結(jié)晶等實(shí)驗(yàn)；測(cè)定蛋白去折疊過程，進(jìn)行蛋白復(fù)性條件篩選；測(cè)定蛋白folding enthalpy，研究蛋白的長(zhǎng)期穩(wěn)定性；測(cè)定不同批次和存儲(chǔ)后的蛋白的穩(wěn)定性，并進(jìn)行相似性評(píng)分，對(duì)蛋白進(jìn)行質(zhì)量控制。

★    280nm激發(fā)光下，蛋白以色氨酸(Trp)釋放的紫外熒光為主

★    Trp熒光光譜與其所處微環(huán)境密切相關(guān)

★    折疊狀態(tài)Trp在蛋白內(nèi)部疏水核心；蛋白去折疊后，Trp暴露到溶劑中

★    去折疊過程, Trp Emission峰值從330nm轉(zhuǎn)變到350nm，蛋白紫外熒光發(fā)生紅移現(xiàn)象

★    350nm與330nm熒光值的比值變化，即可檢測(cè)到蛋白去折疊過程

★    測(cè)定參數(shù)：Tm、Ton、Cm、ΔG等

★    條件無限制，可測(cè)定去垢劑環(huán)境中的膜蛋白

主要功能：

多功能蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16可用于評(píng)估蛋白（抗體或疫苗）熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、顆粒穩(wěn)定性等特性，實(shí)現(xiàn)非標(biāo)記條件下的高通量的抗體制劑篩選、分子結(jié)構(gòu)相似性鑒定、物理穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性、質(zhì)量控制、折疊和再折疊動(dòng)力學(xué)研究等功能。

★    蛋白熱穩(wěn)定性分析

★    蛋白化學(xué)穩(wěn)定性分析

★    蛋白等溫穩(wěn)定性分析

★    蛋白顆粒穩(wěn)定性分析

★    免標(biāo)記熱遷移實(shí)驗(yàn)（dye-free TSA）

★    蛋白去折疊、再折疊、結(jié)構(gòu)相似性分析

★    蛋白質(zhì)量控制分析

主要特點(diǎn)：

多功能蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16基于內(nèi)源差示掃描熒光（ifDSF）技術(shù)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性研究、蛋白質(zhì)類大分子藥物（抗體）優(yōu)化工程、蛋白質(zhì)類疾病靶點(diǎn)的藥物小分子篩選和結(jié)合力測(cè)定等領(lǐng)域，去垢劑環(huán)境中的膜蛋白和高濃度抗體制劑的穩(wěn)定性研究。此外，PSA-16具有非常高的數(shù)據(jù)采集速度，從而可提供超高分辨率的數(shù)據(jù)。同時(shí)一次ZUI多可同時(shí)測(cè)定16個(gè)樣品，通量高；每個(gè)樣品僅需要10-20 uL，樣品用量少，非常適合進(jìn)行高通量篩選。操作簡(jiǎn)單，使用后無需清洗，幾乎無維護(hù)成本，具有快速、準(zhǔn)確、高通量等諸多優(yōu)點(diǎn)。

主機(jī)參數(shù)：

★    測(cè)定參數(shù)：Tm、Cm、ΔG等；

★    樣品通量：16個(gè)；

★    樣品體積：≤20 uL；

★    檢測(cè)器：檢測(cè)330+/-5 nm和350+/-5 nm兩個(gè)波長(zhǎng)的信號(hào)；

★    檢測(cè)模式：快速逐個(gè)掃描，1秒鐘采集一次信號(hào)；

★    激發(fā)光源：LED，波長(zhǎng)280 nm；

★    濃度范圍：0.01-300 mg/ml；單次實(shí)驗(yàn)即可涵蓋此濃度范圍；

★    溫控范圍：15-110度；

★    變溫速度：0.1-15度/分鐘；

★    溫度準(zhǔn)確性：+0.05度；

★    Tm重復(fù)性：同一臺(tái)機(jī)器16個(gè)重復(fù)樣品CV小于1%；

★    對(duì)緩沖液條件無限制，可測(cè)定去垢劑環(huán)境中的膜蛋白；

★    能夠?qū)崿F(xiàn)熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、膠體穩(wěn)定性、等溫穩(wěn)定性、質(zhì)量控制等測(cè)定；

★    儀器無需定期更換配件，實(shí)驗(yàn)完成后無需對(duì)儀器進(jìn)行清洗維護(hù)；

耗材參數(shù)：

★    一次性耗材，無需清洗；成本低；

★    樣品管采用高純度石英材質(zhì)，紫外透過率高，可檢測(cè)低濃度的蛋白樣品；

★    八聯(lián)排設(shè)計(jì)，使用靈活，適配多通道移液器進(jìn)樣；

★    可密封式設(shè)計(jì)，防止實(shí)驗(yàn)過程中的樣品蒸發(fā)；
 

應(yīng)用領(lǐng)域：

蛋白質(zhì)是生物體中廣泛存在的一類生物大分子，具有特定立體結(jié)構(gòu)的和生物活性以及諸多功能，根據(jù)這些功能我們可以將其應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)、蛋白質(zhì)功能的改造、疾病的基因以及新型耐抗藥性藥物的開發(fā)與設(shè)計(jì)甚至是發(fā)現(xiàn)生物進(jìn)化的規(guī)律等先進(jìn)科研領(lǐng)域上。因此，蛋白質(zhì)具有非常重要的研究?jī)r(jià)值。進(jìn)行蛋白質(zhì)性質(zhì)和功能研究的前提是獲得穩(wěn)定的蛋白質(zhì)樣品，而由于蛋白質(zhì)自身性質(zhì)的復(fù)雜性，難以保證獲得的蛋白質(zhì)樣品是否具有正確的三維結(jié)構(gòu)以及功能，因此急需一種技術(shù)手段或設(shè)備，對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，確定獲得蛋白質(zhì)ZUI適宜的緩沖液條件、蛋白質(zhì)的長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性等。另外在進(jìn)行蛋白質(zhì)-配體小分子相互作用研究時(shí)，因?yàn)樾枰Y選的小分子配體數(shù)量巨大，因此也急需一種技術(shù)手段或設(shè)備，可以高通量的對(duì)配體結(jié)合進(jìn)行篩選。

多功能蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16應(yīng)用涵蓋植物、生物學(xué)、動(dòng)物科學(xué)、動(dòng)物醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、工業(yè)發(fā)酵、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)、蛋白質(zhì)工程等多學(xué)科領(lǐng)域。蛋白質(zhì)是ZUI終決定功能的生物分子，其參與和影響著整個(gè)生命活動(dòng)過程?，F(xiàn)代分子生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)、動(dòng)醫(yī)動(dòng)科、農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)等多種學(xué)科研究的很多方向都涉及蛋白質(zhì)功能研究，以及其下游的各種生物物理、生物化學(xué)方法分析，提供穩(wěn)定的蛋白質(zhì)樣品是所有蛋白質(zhì)研究的先決條件。因此多功能蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16在各學(xué)科的研究中都有重要的意義。

蛋白質(zhì)Tm值測(cè)定具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，例如輔助生物藥物開發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量控制，評(píng)估生物相似性、優(yōu)化蛋白藥物配方等，還可以作為探索蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的手段之一指導(dǎo)蛋白質(zhì)工程，如比較不同突變對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，研究結(jié)構(gòu)域改變與功能活性改變關(guān)聯(lián)性等。比較不同Tm值測(cè)定方法，全面了解技術(shù)特點(diǎn)及測(cè)量效果對(duì)于Tm值測(cè)定的實(shí)際應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義，在科研或生產(chǎn)工作中可以靈活選用或聯(lián)用多種技術(shù)來闡明不同條件下的結(jié)構(gòu)變化特點(diǎn)。具體包括以下幾個(gè)月幾個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域：

1.    抗體：抗體作為ZUI主要的蛋白類制品，其穩(wěn)定性研究至關(guān)重要，而且主要集中在上游階段。在上游的抗體發(fā)現(xiàn)階段，需要從眾多候選抗體中篩選出少量的候選抗體轉(zhuǎn)移到下游，傳統(tǒng)測(cè)定的指標(biāo)主要有表達(dá)量和結(jié)合能力（親和力，結(jié)合動(dòng)力學(xué)）等，而抗體的熱穩(wěn)定性也是一個(gè)非常重要的補(bǔ)充指標(biāo)。在完成抗體發(fā)現(xiàn)后，需要研究抗體在什么buffer條件下具有更好的成藥性（粘度合適，滲透壓合適，長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定等），其中抗體的熱穩(wěn)定性是一個(gè)重要的判斷指標(biāo)。

2.    酶制劑：酶作為另一類重要的蛋白制品，對(duì)其穩(wěn)定性的考察也非常重要。工業(yè)酶的工作環(huán)境非?？量?，溫度高，酸堿條件苛刻，某些發(fā)酵產(chǎn)物本身也會(huì)降低蛋白活性（例如產(chǎn)乙醇酶需要耐受高濃度的乙醇），因此需要對(duì)酶進(jìn)行大量的篩選和改造，以獲得活性更高，耐受性更好的酶。通過測(cè)定不同候選酶突變體的熱穩(wěn)定性，以及酶在不同條件下（例如添加不同濃度的乙醇）的熱穩(wěn)定性，可以非常迅速有效的進(jìn)行酶的質(zhì)量的評(píng)價(jià)。

3.    疫苗：滅活疫苗和重組蛋白疫苗，都是蛋白制品。重組蛋白疫苗和抗體非常類似，都是通過外源重組表達(dá)的方式獲得蛋白，因此蛋白穩(wěn)定性分析的應(yīng)用點(diǎn)也類似，主要集中在上游的蛋白發(fā)現(xiàn)和蛋白制劑階段。而滅活疫苗略有不同，滅活疫苗的產(chǎn)品是病毒顆粒，只有完整的病毒顆粒才具有好的免疫源性。熱穩(wěn)定性分析可以測(cè)定顆粒打破和單個(gè)蛋白變性這兩個(gè)階段，因此可以應(yīng)用到制劑開發(fā)和下游的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)。不僅在人用疫苗中有應(yīng)用，獸用疫苗企業(yè)也同樣有應(yīng)用。

4.    化合物藥物：小分子藥物的作用靶點(diǎn)多數(shù)是蛋白。在小分子藥物篩選中，有一個(gè)實(shí)驗(yàn)叫做Thermal shift assay（TSA），通過檢測(cè)蛋白結(jié)合小分子前后的熱穩(wěn)定性變化，來判斷是否發(fā)生了結(jié)合。因此在化合物藥物企業(yè)中，可以推TSA實(shí)驗(yàn)這個(gè)應(yīng)用點(diǎn)。同時(shí)熱穩(wěn)定性也可以作為靶點(diǎn)蛋白質(zhì)量控制的手段，檢查蛋白是否有活性。

實(shí)際案例：

多功能蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16推出市場(chǎng)后，在短短時(shí)間內(nèi)測(cè)試過各種不同類型的樣本，在多個(gè)客戶實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)DEMO，數(shù)據(jù)顯示測(cè)試結(jié)果良好，重復(fù)性優(yōu)異，相關(guān)參數(shù)達(dá)到甚至超過國(guó)外同類產(chǎn)品的水平。

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