STELLARIS故事：與Alberto Diaspro教授的訪談

我最關(guān)注的一個特性是白光激光器。其次是STELLARIS系統(tǒng)處理熒光壽命數(shù)據(jù)的能力。這兩個方面對我們來說非常重要，因為我們在實驗室中已經(jīng)長期應(yīng)用壽命數(shù)據(jù)和相位分析。

是的，我認為 TauSTED 是實現(xiàn) STED 技術(shù)的一大進步。它不僅鼓勵人們使用 STED 技術(shù)，還促使他們利用單光子計數(shù)的優(yōu)勢。

生物實驗的出發(fā)點是問“我想看到什么？”然后是“我需要什么級別的分辨率來看到它？”假設(shè)我知道我需要的分辨率低于衍射極限。那么在實驗室里擁有一種能夠使用兩種激光和一個旋鈕來選擇特殊分辨率的系統(tǒng)來回答我的生物學(xué)問題，并使用第二種激光和旋鈕實時改善空間分辨率，這有多令人興奮？

TauSTED意味著在非常高的分辨率下?lián)碛蟹浅７€(wěn)健的圖像，因為你有額外的數(shù)據(jù)，熒光壽命信息，你正在以巧妙的方式使用這些信息來重建圖像。20世紀(jì)40年代有一位非常著名的科學(xué)家說我們不會克服衍射極限。衍射就在那里，我們只是添加信息——當(dāng)我們重建圖像時，我們可以得到更多的細節(jié)。我們現(xiàn)在可以用TauSTED做的是，以智能的方式添加信息，利用額外的信息來改善圖像重建。這對于共聚焦成像、多光子、STED或任何其他對比機制都是有效的。

是的。我們選擇 STELLARIS 是因為白光激光器（WLL）是一種閉合光譜圈的方式——借助 AOBS，您能夠使用大量光子進行光譜檢測物種。您有非常重要的一點：尊重光子，不丟失光子，以最佳方式使用所有到達的光子。而且通過白光激光，我可以在激發(fā)光譜周圍的區(qū)域內(nèi)調(diào)節(jié)激發(fā)。使用 WLL，我還可以在光漂白方面進行優(yōu)化。當(dāng)我們處理熒光分子時，并非總是在激發(fā)光譜的最大值激發(fā)效果最佳。在某些情況下，如果您可以在其他區(qū)域工作，在回答生物學(xué)問題和需要減少光漂白時，這是一個非常大的優(yōu)勢。

簡而言之，對我們來說擁有 WLL 的主要好處不是可以同時成像 8 個熒光信號。這很棒，但對我們來說，最大的好處是我在激發(fā)和檢測方面有調(diào)節(jié)的自由。這作為照明的時間調(diào)制非常重要。

在培訓(xùn)用戶時，擁有 WLL 的另一個重要方面就體現(xiàn)出來了。在培訓(xùn)新一代顯微鏡專家時，您需要這樣的系統(tǒng)，因為您可以自由選擇激發(fā)的波長并在光譜檢測范圍內(nèi)進行調(diào)節(jié)。這具有巨大的價值，因為它有助于他們真正開始理解熒光的情況。

還有一個方面我覺得很有吸引力：新的探測器系列。當(dāng)你擁有能夠進行單光子計數(shù)的探測器，并且你需要它們來處理壽命問題時，這就意味著在飽和度方面不再有問題。這對生命科學(xué)研究非常重要，對我在材料科學(xué)方面的項目也是如此。

總的來說，這是共聚焦技術(shù)的一個真正的巨大飛躍。分辨率佳。通過使用熒光面板向系統(tǒng)發(fā)出指令的方式，確實有助于了解自己在做什么。光學(xué)切片也非常好。當(dāng)你需要一定的空間分辨率時，取樣的方式也很好。這些天，我對我遇到的所有人說，這是我職業(yè)生涯中使用過的非常好的商用共聚焦系統(tǒng)。

但對我來說，最好的是你們顯示與壽命有關(guān)的數(shù)據(jù)的方式。長期以來，我們一直使用相位法來瀏覽熒光圖像并了解發(fā)生了什么。當(dāng)你在超分辨率下進行此項工作時，這是一個很大的優(yōu)勢。

可對激發(fā)進行調(diào)整，有助于為樣品添加最佳制備。您可以同時進行光譜分析和顯微分析。用戶可以真正優(yōu)化使用該系統(tǒng)收集的數(shù)據(jù)種類。然后再切換到 STED，這真是太棒了。STED 并不意味著只具有超分辨率，而是意味著可以通過旋轉(zhuǎn)旋鈕，自由瀏覽到您感興趣的特殊分辨率，直到找到您想看的東西。這非常令人興奮。我必須承認，當(dāng)您使用STELLARIS工作時，您很難離開實驗室。你會開始探索該系統(tǒng)的所有潛力，而不會意識到時間的流逝！

他們可以開始思考在特定波長激發(fā)的意義。在開始采集一系列圖像（例如30或50張幻燈片）之前，他們可以先進行光譜分析。如果一開始，他們有機會通過調(diào)整激發(fā)波長和光譜窗口來了解發(fā)生了什么，而不是僅僅開始采集數(shù)據(jù)，那么他們的實驗結(jié)果將會更優(yōu)化。這讓他們理解激發(fā)熒光分子意味著什么。首先，他們會遵循系統(tǒng)在設(shè)置中選擇熒光團時給出的建議。但是，能夠操縱激發(fā)和檢測光譜，在不同波長之間滑動，可以讓他們親身體驗信息，而不是簡單地信任它。一個很好的例子是：許多研究人員認為激發(fā)熒光素的最佳波長是488納米，因為在其他使用單線激光器的系統(tǒng)中，這是他們能使用的最佳波長。但如果你能調(diào)節(jié)波長，跟蹤真實的激發(fā)光譜，你就能看到這個光譜在樣品條件下會發(fā)生變化，這樣你就能真正看到激發(fā)和發(fā)射的肩峰。當(dāng)你進行調(diào)節(jié)時，能夠去除不需要的信號。這不僅對培訓(xùn)有好處，對實驗結(jié)果也有益！

當(dāng)你處理一個固定的樣本時，不是說一切都能很好地運作，但大致上都能正常工作。然而，當(dāng)你處理一個活體樣本時，你可能需要改變當(dāng)前的條件，以便更好地觀察發(fā)生了什么。然后，我們有你操作時的定量信息，比如功率，激發(fā)體積……你擁有所有這些數(shù)據(jù)，再加上可調(diào)性。這就是你能夠在你面前優(yōu)化活細胞成像的能力。

這有點像是發(fā)現(xiàn)了一個新世界。最初，理解如何處理這些數(shù)據(jù)可能看起來有點令人畏懼。獲取壽命信息意味著什么？但當(dāng)他們開始使用它時，他們意識到這確實是一種額外的價值，能夠利用壽命信息來區(qū)分不同的熒光物種，并更深入地理解自熒光現(xiàn)象。

使用白光激光，您可以更好地控制您的實驗，但您需要對您要進行的實驗有更多的了解。您要在實驗中加入光譜學(xué)，您需要決定將激發(fā)光譜置于何處，以優(yōu)化您的試樣。對于不太熟悉顯微鏡的研究人員來說，這可能令人害怕，但它能幫助他們了解如何以最佳方式優(yōu)化實驗，從而避免光漂白等現(xiàn)象，真正從樣本中獲得最佳信號。進行科學(xué)研究，而不僅僅是成像。

這種 WLL 很容易調(diào)整。對我們來說，最大的愿望就是能利用 WLL 獲得壽命數(shù)據(jù)，現(xiàn)在我們已經(jīng)做到了。我們還想進行 FRET 實驗，因為 WLL 非常適合這種實驗。您可以以任何方式進行 FRET：光譜偏移、壽命，而且不會因為受限于固定波長而對受體或供體造成不必要的光漂白。現(xiàn)在，您可以選擇最佳波長，而不會破壞實驗。

“如今，我認為這是我在實驗室里用過非常棒的顯微鏡。”

—— Alberto Diaspro教授

是的，我們有研究人員對此感興趣。主要是因為標(biāo)記效率和實驗持續(xù)時間的考量。當(dāng)你向紅外光譜區(qū)域移動時，你可以進行更長時間的實驗，特別是那些對胚胎和斑馬魚、厚的活體樣本感興趣的研究人員，肯定能從紅光擴展中獲益。如果你需要進行深層成像，向紅光區(qū)域發(fā)展總是最佳選擇。

讓我告訴你，我們從Leica Microsystems團隊那里得到了很好的技術(shù)支持。無論何時我們聯(lián)系，總能在極短的時間內(nèi)得到答復(fù)——理解問題所在并提供解決方案，迅速解決問題。這對我們來說非常重要，因為我們的系統(tǒng)總是被預(yù)約得滿滿的。對我來說，Leica Microsystems的技術(shù)服務(wù)是意大利數(shù)一數(shù)二的。當(dāng)你在自己的實驗室中獲得商業(yè)系統(tǒng)，用于個人研究并在機構(gòu)設(shè)施中共享時，優(yōu)質(zhì)的服務(wù)確實能帶來巨大的差異。